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免疫组化图片如何定量分析?

  • 万芸
Medical Research & Publication   2019;5(4):160-162

doi: 10.14218/MRP.2019.071

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先简要介绍几个概念。

免疫组化最常用的是DAB(二氨基联苯胺)染色法,其检测原理主要是首先通过酶标羊抗小鼠/兔IgG聚合物识别连接在组织切片上的一抗,再加入DAB染色液后,聚合物上的辣根过氧化物酶可以催化DAB中的H2O2分解,使联苯胺氧化成联苯亚胺,从而使组织切片中一抗结合的抗原位点出现黄色或黄棕色。此外,还需要用苏木素将组织切片细胞核复染成蓝色。

免疫组化图片数据可以使用图像分析软件进行定量分析。累积光密度(IOD),就是把图片上每个棕色点的光密度值全部累加起来得到的值。平均光密度(Mean density)就是用IOD除以有效目标分布区域的面积(area)所得到的值。免疫组化照片主要是比较组别间平均光密度的大小。今天给大家介绍最常用的图像分析软件:ImagePro Plus的基本使用方法。

1. 校正图片光密度

(1)点击file-open,打开一张图片,然后点击:measure -carliberation- intensity,调出intensity校正窗口。

(2)在窗口里点new,新建一个caliberation set,然后选择std option density,这时窗口中的直线变成了反向的曲线。

  

(3)定白点,扣除背景。点option,在弹出的小窗口里设置black level为0,点image按钮,然后在图片上各个最白的地方点一下,在其显示的数值中选择一个差不多的整数,比如230,或220。最后在incident level中把默认的255改为230或220。点击OK。

  

(4)点击右上角的systerm按钮,最后点击close关闭窗口。设置后测量的光密度值与样品浓度呈正比关系。

2. 选色

点击process,在segmentation中点击右上角的下拉菜单,选择使用HSI颜色系统,H 为色调,S 为色饱和度,I 为强度。设置H:0-30、S:0-255、I:0-230,然后点file-save file。默认的保存文件名是rgb24.rge。注意HSI的选择范围是根据图片情况调整。

  

3. 设置分析环境

(1)点击measure,选择count/size,点击select measurement。一般选择IOD和默认的area进行测量。(area的过滤值,默认为10,可以设置到25-50,去掉小的杂点)

  

(2)点击option,outline下拉选择filled,label style下拉选择none,smoothing设置1,其他的不选。点击OK。

(3)在count/size窗口中点file--file save settings。保存环境设置文件。

4. 测量

(1)用irregular工具画出测量区域。

这里需要区别是否要圈定测量区域:当测量整张照片的光密度时,就不必画测量区域。如果照片有些地方需要剔除,例如有个角正处于切片边缘,没有细胞,需要把这个角上的空白面积扣掉,此时画的“测量区域”就应该沿着样品的边缘来画。

(2)点击count按纽。测量数据在view statistics窗口中,读取IOD SUM数值,作为这张照片的累积光密度值。

  

5. 数据处理

(1)测量每张照片的IOD SUM,如果有选定测量区域,还需测量area。平均光密度,反映了这张照片上免疫反应物的表达强度。mean density = (IOD SUM)/area, mean density 和 IOD 都是个相对值,所以是没有单位的。

首先分别测量出每组中每个样品几张照片的mean density,然后算出平均值作为这个样品的mean density。一个实验组的几个样品测量值可以计算其平均值与标准差,最后用这个平均值来统计各组间的差异。